a) mempersiapkan alat untuk praktikum;
b) membersihkan alat dan sekaligus mensterilkannya dengan memakai alkohol 96 %,
c) mengeringkan alat tersebut di dalam inkubator selama sekitar satu jam;
d) mempersiapkan mikroskop;
e) mempersiapkan zat untuk investigasi mikroskopik; dan
f) melaksanakan investigasi mikroskopik sesudah penilaian makroskopik.
Tahapan penilaian semen secara mikroskopik mencakup :
a) Motilitas Progresif Spermatozoa
Pengamatan motilitas progresif spermatozoa sekaligus sanggup mengevaluasi gerak massa dan gerak individu spermatozoa. Alat yang dipakai untuk mengevaluasi motilitas adalah: mikroskop; contoh semen; gelas pengaduk; alkohol 70 –90 %; gelas objek (object glass); gelas epilog (cover glass); kertas pengering (tissue); dan kapas.
 |
| Gambar 37. Evaluasi semen secara mikroskopik |
Teknik pelaksanaan penilaian mikroskopik untuk motilitas spermatozoa yakni sebagai berikut :
1) bersihkan gelas objek dengan kapas yang telah diberi alkohol, sehingga bebas kotoran dan lemak;
2) masukkan alat-alat ke dalam inkubator;
3) keluarkan alat (gelas objek) dan lap kembali dengan kertas tissue;
4) kocok tabung hingga semen homogen;
5) ambil setetes semen letakkan di atas gelas objek dan tutup dengan gelas penutup;
6) letakkan gelas objek di bawah mikroskop dengan perbesaran 10 x 10 memakai cahaya redup
 |
| Gambar 38. Evaluasi gerak massa spermatozoa |
(1) Evaluasi Gerak Massa
Kriteria penilaian untuk gerak massa spermatozoa yakni sebagai berikut :
(a) tampak di bawah mikroskop gerakan gelombang besar, banyak, gelap, tebal, dan aktif ibarat gumpalan awan hitam mendekati waktu hujan, dan cepat berpindah-pindah. Kondisi tersebut berarti menawarkan motilitas spermatozoa sangat baik atau baik sekali (diberi tanda +++);
(b) tampak gerakan gelombang kecil, tipis, jarang, kurang jelas, dan lamban. Evaluasii gerakan tersebut yakni baik (diberi tanda ++);
(c) gerakan yang tampak kurang baik, tidak terlihat gerakan gelombang, melainkan hanya gerakan individu spermatozoa dan tidak progresif. Evaluasi motilitas yakni cukup (diberi tanda +);
(d) tampak di bawah mikroskop gerakan spermatozoa hanya sedikit, tidak ada gereakan individu sama sekali. Evaluasi motilitas yakni buruk (diberi tanda N = necrospermia)
(2) Evaluasi Gerak Individu
Kriteria penilaian untuk gerak individu spermatozoa yakni sebagai berikut :
(a) tampak gerakan spermatozoa progresif maju ke depan (diberi tanda p= progresif);
(b) tampak gerakan spermatozoa mundur (diberi tanda r = reserve);
(c) tampak gerakan spermatozoa bergetar (diberi tanda v = vibratory); dan
(d) tampak gerakan spermatozoa berputar (diberi tanda s = sirkuler).
(3) Evaluasi Motilitas Lainnya
Kriteria penilaian untuk motilitas lainnya yakni sebagai berikut :
(a) tidak ada gerakan spermatozoa atau immotil (diberi angka penilaian 0);
(b) gerakan spermatozoa berputar di daerah (diberi angka penilaian 1);
(c) gerakan spermatozoa berayun atau melingkar; kurang dari 50 % spermatozoa bergerak progresif, dan tidak ada gerakan gelombang (diberi angka penilaian 2);
(d) sebanyak 50 –80 % spermatozoa bergerak progresif, dan terdapatgerakan massa spermatozoa (diberi angka penilaian 3);
(e) sebanyak 90 % spermatozoa bergerak motil progresif, membentuk gerakan gelombang (diberi angka penilaian 4); dan
(f) gerakan spermatozoa progresif, gerakan gelombang sangat cepat, dan diperkirakan sebanyak 100 % motil aktif (diberi angka penilaian 5). Untuk sanggup diproses lebih lanjut, maka angka motilitas spermatozoa minimal sebanyak 50 –80 % (atau angka penilaian 3). Semakin tinggi angka evaluasi, maka semakin baik kualitas spermatozoa yang akan digunakan.
b) Persentase Spermatozoa Hidup
Evaluasi spermatozoa hidup dan spermatozoa mati memakai zat warna eosin atau eosin negrosin. Dasar pola yang dipakai yakni sel yang telah mati daya permeabilitasnya meningkat sehingga daya serap terhadap zat warna tertentu meningkat pula. Spermatozoa yang mati akan menyerap zat warna eosin sehingga warnanya merah, sedangkan spermatozoa yang hidup tidak menyerap warna (Gambar 39).
 |
| Gambar 39. Persiapan penilaian hidup mati spermatozoa |
Alat yang dipakai untuk penilaian hidup mati spermatozoa yakni sebagai berikut :
1) gelas objek;
2) pipet;
3) NaCl 3 %;
4) NaCl fisiologis (9%);
5) zat warna eosin atau eosin negrosin;
6) batang gelas pengaduk;
7) lampu Bunsen; dan
8) mikroskop.
Teknik pelaksanaan penilaian hidup mati spermatozoa yakni sebagai berikut :
1) panaskan sebanyak 4 buah gelas objek pada suhu 37 deratjatC
2) zat warna dipanaskan sehingga mencapai suhu 37 derajat C
3) teteskan zat warna pada bab pinggir salah satu gelas objek;
4) goyang-goyang semen hingga homogen, kemudian ambil contoh semen memakai batang gelas, teteskan semen ke gelas obyek, kemudian campurkan secara merata dengan zat warna;
5) ambil gelas objek yang lain, tempelkan bab ujungnya pada semen yang telah bercampur zat warna;
6) letakkan ujung gelas objek yang telah terkena semen dengan posisi miring sekitar 30 derajatpada gelas objek yang lain;
7) usapkan semen tersebut segera tipis-tipis, kemudian diangin-anginkan atau dipanaskan di atas api Bunsen;
8) sesudah kering sediaan (preparat) diamati di bawah mikroskop perbesaran 45 x 10 atau 100 x 10 (menggunakan minyak emersi);
9) hitung spermatozoa yang berwarna merah dan yang tidak berwarna sebanyak 200 ekor;
10) lakukan penghitungan 3 kali pada bidang pandang yang lain (hasilnya dirata-rata); dan
11) persentase spermatozoa hidup yakni jumlah spermatozoa yang mati (warna merah) dibagi total spermatozoa yang diamati kali 100 persen
c) Persentase Spermatozoa Abnormal
Evaluasi ketaknormalan spermatozoa dibagi dalam dua kelompok, yaitu :
1) ketaknormalan primer dan
2) ketaknormalan sekunder.
Spermatozoa yang masuk kategori ketaknormalan primer yakni kelainan yang terjadi semenjak pembentukan spermatozoa di dalam organ kelamin primer (testis) dalam proses spermatogenesis. Abnormalitas sekunder yakni kelainan spermatozoa yang terjadi akhir tekanan fisik untuk penilaian semen, contohnya akhir mengocok tabung terlalu keras, penurunan suhu terlalu cepat, suhu pemanasan yang terlalu tinggi, dan atau ketika pembuatan sediaan (preparat) yang tidak hati-hati.
 |
| Gambar 40. Aneka bentuk ketaknormalan spermatozoa |
Abnormalitas primer ditandai dengan adanya beberapa kelainan, ibarat kepala kecil, kepala besar, bentuk kepala kerucut, kepala miring, kepala dua, kepala bulat, ekor dua, akrosoma salah bentuk, dan leher besar. Abnormalitas sekunder ditandai dengan adanya kelainan ibarat kepala terlepas, leher patah, ekor patah, dan ekor bergelung (Gambar 40).
Alat yang dipakai untuk sediaan penilaian persentase spermatozoa hidup sanggup juga dipakai untuk penilaian ketaknormalan spermatozoa, dan mikroskop.
Teknik pelaksanaan penilaian yakni sebagai berikut :
1) letakkan sediaan di bawah mikroskop dengan perbesaran 45 x 10;
2) amati dan hitung spermatozoa yang normal dan abnormal primer minimal sebanyak 200 sel;
3) apabila dari hasil penilaian jumlah spermatozoa abnormal primrer ≥ 20 %, berarti kualitas spermatozoanya jelek;
4) bila dari hasil penilaian jumlah spermatozoa abnormal sekunder ≥ 25 %, maka pembuatan sediaan harus diulang;
5) bila total spermatozoa abnormal baik primer maupun sekunder = 20 %, maka kualitas spermatozoanya masih termasuk kategori normal untuk dipakai
d) Konsentrasi Spermatozoa
Konsentrasi spermatozoa yakni salah satu penilaian untuk mengetahui jumlah total spermatozoa per ml cairan semen. Meskipun penilaian perhitungan konsentrasi bersifat pendugaan, namun validitas angkanya terjamin.
Evaluasi konsentrasi ada 2 cara, yaitu :
1) pendugaan menurut jarak antar kepala spermatozoa, dan
2) memakai bilik hitung Neubauer atau Thoma (Gambar 41).
1) Pendugaan konsentrasi menurut jarak antar kepala.
Alat yang dipakai yakni mikroskop; gelas objek; gelas penutup; dan contoh semen.
 |
| Gambar 41. Penetesan semen ke bilik hitung Neubauer (Thoma) untuk mengevaluasi konsentrasi spermatozoa |
Teknik pelaksanaannya yakni sebagai berikut :
(a) teteskan sedikit contoh semen ke atas gelas objek;
(b) tutup tetes semen dengan gelas penutup;
(c) letakkan sediaan di bawah mikroskop perbesaran 45 x 10;
(d) amati jarak antara kepala spermatozoa,
Hasil evaluasinya yakni sebagai berikut :
(a) Densum(D) atau padat, kalau jarak antara dua kepala spermatozoa kurang dari panjang satu kepala spermatozoa; dugaan konsentrasinya yakni sekitar 1.000 hingga 2.000 juta spermatozoa per ml semen.
(b) Semidensum (SD) atau sedang, bila jarak antar kepala spermatozoa panjangnya 1 hingga 1½ kepala spermatozoa; dugaan konsentrasinya yakni 500 hingga 1.000 juta spermatozoa per ml semen.
(c) Rarum (R) atau jarang, kalau jarak antara kepala spermatozoa melebihi 1½ hingga seluruh panjang spermatozoa; dugaan konsentrasinya sekitar 200 hingga 500 juta spermatozoa per ml semen.
(d) Oligospermia (OS) atau sedikit, bila jaraknya lebih dari seluruh panjang spermatozoa; dugaan konsentrasinya sekitar 200 juta spermatozoa per ml semen.
(e) Aspermia (A) atau tidak ada spermatozoa, bila dari pengamatan tidak ada sama sekali spermatozoa dari contoh sediaan.
2) Evaluasi konsentrasi memakai bilik hitung Neubauer (Thoma)
Alat yang dipakai yakni mikroskop; bilik hitung Neubauer (Thoma); gelas penutup; methylen blue; NaCl 3%; pipet eritrosit (erythrocyt pipette); contoh semen; dan kertas pengering (tissue) Teknik pelaksanaannya yakni sebagai berikut :
(a) Siapkan bilik hitung Neubauer di bawah mikroskop perbesaran 45 x 10, tepatkan kotak kecil Neubauer di bawah bidang pandang (Gambar 42);
(b) Hisap semen memakai pipet eritrosit hingga angka 0.5;
(c) Kemudian hisap larutan NaCl 3% hingga angka 101 (NaCl 3% sebagai pengencer semen sekaligus pembunuh spermatozoa);
(d) Kocok pipet dengan membentuk angka 8 selama 2 hingga 3 menit secara hati-hati dan cepat;
(e) Buang 2 hingga 3 tetes semen dari dalam pipet, dan keringkan ujung pipet dengan tissue;
(f) Teteskan semen ke kotak Neubauer dan tutup dengan gelas penutup;
(g) Hitung total spermatozoa yang berada di dalam kotak menyilang dan kotak pojok dari 16 kotak kecil (Gambar 42);
(h) Ulangi penghitungan hingga 3 kali dari bidang pandang yang lain, rata-ratakan hasilnya;
(i ) Misalnya hasil pengamatan total spermatozoa yakni = X , maka konsentrasi spermatozoa yakni X x 10 pangkat 7/ml semen.
 |
| Gambar 42. Kotak-kotak kecil bilik hitung Neubauer |